前　言

　　由病毒、細(xì)菌或其他病原微生物為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)增殖等制成的減毒、滅活的病原體，或再經(jīng)分離、提取等方法制備的富含免疫原性組份（亞單位），免疫機(jī)體后可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答而達(dá)到預(yù)防某種疾病的產(chǎn)品，為預(yù)防用疫苗。

　　本指導(dǎo)原則僅適用于采用傳統(tǒng)方法（滅活、減毒、分離提?。┲苽涞念A(yù)防用疫苗，目的是為該類制品的臨床前研究提供應(yīng)遵循的原則。

　　一、基本原則

　?。ㄒ唬?yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的要求；

　?。ǘ?yīng)對所預(yù)防的疾病的流行情況進(jìn)行分析，包括疾病的危害程度，所涉及的人群特點(diǎn)，病原體的分型及流行趨勢等；

　　（三）應(yīng)對疫苗的有效性、安全性及必要性進(jìn)行分析；

　?。ㄋ模┰u估疫苗接種的風(fēng)險與效益，并提出擬采取避免或減少其危害性或不良反應(yīng)的措施。

　　二、用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種

　　疫苗生產(chǎn)用菌毒種必須證明為引起相應(yīng)疾病的細(xì)菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，應(yīng)明確提供以下信息：

　?。ㄒ唬┚局昝Q及來源

　　1.菌毒株名稱。

　　2.菌毒株來源：

　?。?）菌毒株來源的宿主一般情況。

　?。?）發(fā)病地點(diǎn)、發(fā)病日期；臨床確診疾病名稱及日期、實驗室確診的主要依據(jù)、檢測項目、結(jié)果及日期；病人病程及轉(zhuǎn)歸。

　　3.菌毒株分離樣本來源：咽拭子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、組織標(biāo)本。取樣日期；取樣時病人的病期。應(yīng)提供病人治療期間使用的主要藥物包括抗生素、抗病毒藥物的劑量和療程等資料。鑒于人類的血液、腦脊液等在同一時間內(nèi)相對較少感染多種病毒或細(xì)菌，因此用病人血液等分離的菌、毒株較適宜用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。

　　其他來源分離的菌、毒株的自然樣本參照上述要求提供相應(yīng)資料。

　　（二）菌、毒株分離過程

　　1.病毒分離用細(xì)胞名稱、代次、來源應(yīng)清楚，應(yīng)進(jìn)行無菌、支原體和外源因子等檢測；病毒分離不得使用腫瘤原性的細(xì)胞系，應(yīng)使用非腫瘤原性細(xì)胞，如原代細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞或Vero細(xì)胞等。

　　2.病毒分離用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養(yǎng)條件和制備毒種的動物臟器名稱等需詳細(xì)記載；如再適應(yīng)到細(xì)胞，應(yīng)參照上述對病毒分離用細(xì)胞的要求。

　　3.菌毒株分離用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條件需確定。

　?。ㄈ┚?、毒株分離傳代特性

　　應(yīng)包括樣品處理方法、確證菌毒株首次陽性的代次、菌毒株檢定方法、每代培養(yǎng)條件、滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。

　?。ㄋ模┚痉N庫的建立和保存

　　原始種子批是指已適應(yīng)到可生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞或培養(yǎng)基，可穩(wěn)定傳代、具有良好的免疫原性、并經(jīng)過檢定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種。應(yīng)提供原始菌毒種代次、滴度，添加的保護(hù)劑的名稱和濃度、存儲條件等資料。種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》“生物制品制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求，應(yīng)對種子批進(jìn)行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始菌毒種的一致性。

　　1.應(yīng)提供候選菌毒種研究資料

　　在建立原始菌毒種庫前應(yīng)考慮候選菌毒種的研究：包括收集不同地區(qū)的（不同地域、發(fā)病率和民族）、不同時期的（近年與往年）、不同年齡和性別、疾病不同癥狀或嚴(yán)重程度、不同樣本采集方式或來源（如血液、腦脊液、咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等）的至少10個以上菌毒株進(jìn)行生物學(xué)等研究和比較，分析其異同點(diǎn)，為建立菌毒種庫提供依據(jù)。

　　2.三級種子庫建立的研究資料

　　選擇由多個候選菌毒種篩選獲得的有代表性的2-3株菌毒種，用適宜的方法進(jìn)行毒株的純化，如空斑形成試驗，挑取遺傳穩(wěn)定性與原始種子一致的，至少在主要保護(hù)區(qū)域核苷酸及氨基酸序列一致的毒株。同時進(jìn)行三級種子批建立和工藝適應(yīng)性、免疫原性和免疫效果比較研究。分析在種子批建立傳代過程中不同菌毒種的遺傳穩(wěn)定性、病毒滴度及免疫原性資料；比對不同菌毒種對發(fā)酵、培養(yǎng)、收獲、純化等生產(chǎn)工藝和滅活工藝的適應(yīng)性；考核不同菌毒種的免疫原性和免疫效果；對不同菌毒種的交叉保護(hù)水平和能力進(jìn)行比較研究，確定交叉保護(hù)范圍廣、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答能力強(qiáng)的毒株。通過以上研究結(jié)合疫苗配方探討，綜合判斷、確定應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)的最佳菌毒株。

　　原始種子、主種子、工作種子及疫苗代次的毒株遺傳穩(wěn)定性應(yīng)保持一致。

　?。ㄎ澹┚痉N的檢定

　　1.鑒別試驗：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進(jìn)行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護(hù)性進(jìn)行分析和研究。對某些病原體，即使菌毒株為同一基因型或同一血清型，也應(yīng)對不同菌毒株的抗原性、免疫原性以及交叉保護(hù)能力進(jìn)行比較。

　　2.純菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。

　　3.外源因子檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。

　　4.感染性滴度：應(yīng)能達(dá)到按生產(chǎn)工藝要求順利生產(chǎn)合格疫苗的要求。應(yīng)建立測定菌毒種感染性滴度的方法和標(biāo)準(zhǔn)，并提供這些感染性滴度與疫苗有效性之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。

　　5.免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標(biāo)，應(yīng)制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，以評估該候選菌毒種能否進(jìn)行疫苗生產(chǎn)。

　　6.減毒特性

　?。?）如研制減毒活疫苗應(yīng)對原始菌毒株的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性進(jìn)行研究；應(yīng)提供減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒后的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性及減毒穩(wěn)定性資料，并進(jìn)行減毒前后的特性對比，尤其要對減毒后的安全性和免疫原性做出確切的結(jié)論。

　?。?）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗證方法、醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理動物模型和減毒后安全性的標(biāo)準(zhǔn)以及檢測方法和警戒毒力回復(fù)的依據(jù)等。

　?。?）注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應(yīng)驗證無逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。該驗證方法可采用PERT法等。

　　（4）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗證要求可參考《IABSS cientificworkshoponneurovirulencetestforlivevirusvaccines，WHO，31January2005》。

　　三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究

　　（一）生產(chǎn)用菌毒種批的遺傳穩(wěn)定性分析

　　確定工作種子批和疫苗代次的菌毒株主要保護(hù)區(qū)域核苷酸及氨基酸序列在傳代過程中發(fā)生改變的頻率。生產(chǎn)用菌毒種、細(xì)胞和涉及生產(chǎn)的工藝技術(shù)應(yīng)注意專利，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)專利查詢。

　?。ǘ┥a(chǎn)用細(xì)胞和/或培養(yǎng)基

　　1.生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，除原代細(xì)胞外，采用其他細(xì)胞系應(yīng)建立細(xì)胞庫。

　　2.生產(chǎn)用培養(yǎng)基盡可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應(yīng)的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性原材料。

　?。ㄈ┮呙缟a(chǎn)工藝的研究

　　生產(chǎn)工藝需進(jìn)行驗證。對疫苗生產(chǎn)中菌毒種代次、菌毒種接種量、收獲次數(shù)、滅活工藝及驗證、半成品配制、分批等要求，應(yīng)按現(xiàn)行版《中國藥典》執(zhí)行。

　　1.原液生產(chǎn)的主要技術(shù)參數(shù)的確定

　?。?）病毒與細(xì)胞的接種比例或者M(jìn)OI的最佳參數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間等條件。菌毒種的接種量、培養(yǎng)和發(fā)酵條件等技術(shù)參數(shù)。

　　（2）滅活劑的選擇和依據(jù)。

　?。?）滅活、裂解、減毒或脫毒效果的驗證。效果驗證的依據(jù)、方法，應(yīng)采用盡可能敏感的細(xì)胞或培養(yǎng)基和方法進(jìn)行。

　?。?）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：應(yīng)對純化和提取工藝中各種條件進(jìn)行優(yōu)化，確定純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響；應(yīng)建立穩(wěn)定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩(wěn)定性，并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)和檢測方法。

　?。?）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產(chǎn)出比的數(shù)據(jù)。

　　2.對佐劑的要求

　　新型疫苗應(yīng)用的佐劑包括3類：分別為目前常用的鋁佐劑；批準(zhǔn)用于某些疫苗的佐劑如MF59等；新開發(fā)研制尚未用于疫苗特別是預(yù)防性疫苗的佐劑如CpG等。一般情況下，抗原量及免疫原性能滿足免疫保護(hù)的需要，則不使用佐劑為宜。

　?。?）是否選擇鋁佐劑，應(yīng)根據(jù)疫苗抗原的免疫原性、抗原與佐劑最優(yōu)配比等綜合考慮。應(yīng)注意不同種類抗原與鋁佐劑制備疫苗后，鋁佐劑對抗原的免疫增強(qiáng)作用可能有所差異，甚至不同制備批的鋁佐劑之間也有不同。

　?。?）對其他已經(jīng)批準(zhǔn)用于上市疫苗的佐劑，只需提供該類制劑的組分或化學(xué)組成，國內(nèi)外使用該類制劑的情況，無需對該佐劑再單獨(dú)進(jìn)行毒理和安全性研究，但應(yīng)對疫苗成品進(jìn)行嚴(yán)格的安全性研究，醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理獲得新型疫苗中佐劑的安全性資料。

　?。?）若國內(nèi)外均未使用過該類佐劑，則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究并建立切實可行的評價方法。

　　（四）疫苗的配方研究

　　應(yīng)對疫苗的配方進(jìn)行研究，如疫苗中添加的穩(wěn)定劑、緩沖液、以及賦形劑等是否對疫苗的免疫原性和安全性造成影響。

　　四、藥理、毒理和生物分布

　　疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒理的試驗要求具有特殊性。由于各項藥理、毒理試驗是互相關(guān)聯(lián)的，因此在試驗和評價時應(yīng)綜合考慮相關(guān)的因素。

　　藥理學(xué)試驗主要包括疫苗的作用機(jī)理和免疫原性。應(yīng)建立適當(dāng)?shù)脑囼灧椒ㄔu價疫苗的免疫原性。如果有動物模型或可建立動物模型，可以采用動物模型直接評價疫苗的免疫原性。對一些有動物模型的感染性疾病，可以采用病原體的攻擊試驗評價該疫苗的保護(hù)效果。若無法建立動物模型，應(yīng)建立能驗證該疫苗有效性的體外試驗進(jìn)行評價。應(yīng)考察接種的劑量與免疫原性的關(guān)系，通過試驗優(yōu)化免疫程序和接種途徑。

　　疫苗的動物長期毒性試驗及毒理學(xué)試驗應(yīng)選用相關(guān)種屬或品系的動物進(jìn)行，至少選擇一種相關(guān)動物進(jìn)行毒性試驗。試驗內(nèi)容主要包括重復(fù)給藥毒性試驗、急性毒性試驗、局部刺激性試驗等，必要時還應(yīng)包括生殖毒性試驗。接種劑量原則上應(yīng)使疫苗在動物體內(nèi)達(dá)到最佳的免疫應(yīng)答。疫苗的動物長期毒性試驗不需要每日給藥，接種次數(shù)建議至少比臨床擬定的接種次數(shù)多1次，一般采取2～3周的暴露間隔。試驗應(yīng)考察接種部位和全身的病理反應(yīng)，應(yīng)盡可能進(jìn)行疫苗的免疫原性試驗，包括血清中和抗體效價或其它與免疫應(yīng)答有關(guān)的研究，重點(diǎn)考察疫苗誘導(dǎo)的免疫毒性作用，需關(guān)注對疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性細(xì)胞因子和與毒性有關(guān)的炎癥因子的檢測和分析。

　　疫苗通常不需要進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。必要時，應(yīng)建立敏感的動物模型考察減毒活疫苗的生物分布，測定接種疫苗后的病毒血癥（或菌血癥）以及持續(xù)時間、排毒（菌）方式和途徑，對是否呈現(xiàn)體內(nèi)復(fù)制及器官組織的感染應(yīng)進(jìn)行研究。

　　五、質(zhì)量控制要求

　　在生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟中的產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進(jìn)行，保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的穩(wěn)定性。應(yīng)在研發(fā)階段建立疫苗的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和參考品，應(yīng)建立并驗證純度、雜質(zhì)殘留、抗原、抗體、生物效力的定量檢測方法；單劑疫苗不應(yīng)添加含汞防腐劑。疫苗生產(chǎn)在培養(yǎng)階段不得添加抗生素。對種子培養(yǎng)階段添加抗生素的應(yīng)按現(xiàn)行版《中國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

　　1.工作種子批毒種制備階段應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其遺傳穩(wěn)定性，建立鑒別試驗、病毒滴度檢查、毒株免疫原性試驗的方法和標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.對純化工藝應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其純化產(chǎn)物、原液的抗原純度，建立用于評價純化產(chǎn)物所含有效成分的最低限量和雜質(zhì)的最高限量方法，通?？蓽y定有效抗原在疫苗中的絕對值或測定主要雜質(zhì)的量推算有效抗原在疫苗中的相對值。采用人二倍體細(xì)胞以外的細(xì)胞生產(chǎn)的，應(yīng)建立用于評價純化產(chǎn)物、原液中宿主細(xì)胞DNA和蛋白殘留量的方法。對生產(chǎn)過程中使用滅活劑的疫苗，應(yīng)建立有效的滅活方法，對滅活效果進(jìn)行驗證；建立用于評價純化產(chǎn)物、醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理原液、成品中滅活劑殘留量檢測的方法。建立上述檢測方法時應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，并按藥典中有關(guān)方法學(xué)驗證指南對方法、試劑、標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性和特異性等進(jìn)行驗證，并制定相應(yīng)的限量范圍，以達(dá)到控制生產(chǎn)批間的一致性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的目的。

　　3.申報疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不得低于現(xiàn)行版《中國藥典》和WHO相關(guān)指南的要求。對于能夠定量檢測的安全性、有效性的指標(biāo)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)根據(jù)多批（有統(tǒng)計學(xué)意義的）產(chǎn)品，多次測定的試驗數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后擬定，計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)綜合考慮方法學(xué)的變異情況，確定合理的上下限要求，一般均值加減不得高于2.58個標(biāo)準(zhǔn)差作為上下限。

　　4.在半成品和成品階段的質(zhì)量控制至少包括：

　?。?）鑒別試驗、裝量。

　?。?）化學(xué)指標(biāo)：pH值，佐劑、滅活劑以及其他殘留有機(jī)溶劑。

　?。?）無菌檢查、異常毒性、熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

　?。?）生物效價：應(yīng)建立體內(nèi)或體外檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)。體內(nèi)效力試驗一般采用小鼠ED50的方法。由于用于預(yù)防的疫苗是通過機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生作用的，因此應(yīng)評價其體液免疫和細(xì)胞免疫水平。在評價體液免疫效價時，應(yīng)選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的檢測方法，并對該類方法進(jìn)行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)建立評價抗體質(zhì)量的方法，對抗體的性質(zhì)進(jìn)行評價，如亞型測定及抗原中和位點(diǎn)分析等；在評價細(xì)胞免疫效價時，可建立檢測評價細(xì)胞免疫的方法（如Elispot方法等），也可通過對細(xì)胞因子的定量檢測評價其細(xì)胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項目，方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。若有動物模型，可進(jìn)行動物保護(hù)性試驗。

　?。?）抗生素：按現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求執(zhí)行。

　　5.疫苗標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的研究：應(yīng)在疫苗研發(fā)階段考慮研究、建立穩(wěn)定工藝后的疫苗抗原參考品，以及疫苗效力、免疫原性檢測的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品。疫苗抗原參考品與其后生產(chǎn)多批次疫苗的質(zhì)量控制指標(biāo)的比對，可了解在上市后生產(chǎn)的疫苗抗原較研發(fā)階段的抗原在質(zhì)量上有無改變。疫苗效力、免疫原性檢測的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品可用于疫苗效力指標(biāo)的質(zhì)量控制。

　　六、穩(wěn)定性試驗

　　穩(wěn)定性試驗是指疫苗在規(guī)定保存溫度下的穩(wěn)定性試驗。由于穩(wěn)定性試驗的結(jié)果直接與制品的效期有關(guān)，且試驗觀察時間較長，因此應(yīng)在生產(chǎn)工藝確定后盡早留樣進(jìn)行，定期取樣測定制品效力和其他相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)。對穩(wěn)定性試驗結(jié)果與加速穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對比，可為正式產(chǎn)品的有效期確定提供依據(jù)。

　　七、疫苗劑量和免疫程序的研究

　　應(yīng)依據(jù)動物試驗中不同接種劑量、不同劑次的抗體陽性率醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理、應(yīng)答水平等免疫原性指標(biāo)，結(jié)合疫苗目標(biāo)人群感染前后、一般健康人群的抗體陽性率和水平等流行病學(xué)資料，綜合擬定疫苗申報臨床的劑量和程序。

　　八、臨床研究用樣品要求

　?。ㄒ唬┥暾埮R床試驗用的疫苗和對照品，按照國家GMP的要求，在符合現(xiàn)行中國藥品GMP的條件下生產(chǎn)；

　　（二）臨床試驗用疫苗樣品應(yīng)與臨床前研究用質(zhì)量相同，其批量一般不少于1000人份，并能滿足臨床試驗對疫苗數(shù)量的要求；

　?。ㄈ┻M(jìn)行臨床試驗的疫苗和對照品必須由中國藥品生物制品檢定所進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核；

　?。ㄋ模衿诤廷蚱谂R床試驗后，可以根據(jù)結(jié)果對生產(chǎn)工藝、質(zhì)量指標(biāo)等進(jìn)行調(diào)整；Ⅲ期臨床試驗用樣品的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量指標(biāo)及生產(chǎn)規(guī)模和場地，原則上應(yīng)與疫苗批準(zhǔn)上市后的一致。