酶聯(lián)免疫吸附試驗的標記方法是臨床醫(yī)學檢驗士考試中可能會遇到的問題,為此醫(yī)學教育網(wǎng)的小編特為您整理撰文如下:
良好的酶結(jié)合物取決于兩個條件:即高效價的抗體和高活性的酶??贵w的活性和純度對制備標記抗體至關(guān)重要,因為特異性免疫反應(yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中,抗體的活性有所降低,故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白,最好使用親和層析提純的抗體,可提高敏感性,而且可稀釋使用,減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián),常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行,標記效果好,特別適用于實驗室的小批量制備。其標記程序為:將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中,加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml,混勻置4℃冰箱30分鐘 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml,混勻并裝透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(或過夜)使之結(jié)合,然后吸出,加硼氫化鈉(NaBH4)溶液(5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小時,將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液,置4℃冰箱30分鐘后離心,將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中,并對之透析過夜(4℃),次日離心除去不溶物,即得到酶標抗體,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進行測定后,冷凍干燥或低溫保存。