酶免技術常應用的酶有辣根過氧化酶和堿性磷酸酶，針對不同的酶，所作用的底物又是不同的。

　　1.辣根過氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18%；分子量為44kD；是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成的一種卟啉蛋白質。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有最高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，

　　在403nm波長處有最高吸收峰。HRP對受氫體的專一性很高，除H₂0₂外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H₂0₂方便。

　　許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯苯胺（TMB）和ABTS。OPD為在ELISA中應用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點。TMB經酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應后變黃色，可在比色計中定量；因此應用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。

　　2.堿性磷酸酶（AP）：是從牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸黏膜提取的AP分子量為100kD，最適pH為9.6。一般采用對硝基苯磷酸酯（p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一段時間。

　　在ELISA中應用AP系統，其敏感性一般高于應用HRP系統，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結合物時得率較HRP低等醫(yī)學教丨育網整理原因，國內在ELISA中一般均采用HRP。

　　3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-半乳糖苷，經酶水解后產生熒光物質4-甲基傘酮，可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應用可產生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點是酶作用后反應液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內沒有內源酶。