摘要：RNA-Seq可進(jìn)行全基因組水平的基因表達(dá)差異研究，具有定量更準(zhǔn)確、可重復(fù)性更高、檢測(cè)范圍更廣、分析更可靠等特點(diǎn)。除了分析基因表達(dá)水平，RNA-Seq還能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、SNP、剪接變體，并提供等位基因特異的基因表達(dá)。對(duì)于RNA-Seq的優(yōu)缺點(diǎn)，Helicos BioSciences的研究人員在《PloS ONE》上做了清晰闡述。

    一直以來，研究人員都很有興趣了解細(xì)胞在各種不同狀態(tài)下的基因表達(dá)差異，并開發(fā)出多種方法，來不斷提高靈敏度和增加通量�；�因表達(dá)芯片是近年來較多采用的方法，但它如今卻碰上了一個(gè)強(qiáng)勁對(duì)手——RNA-Seq.

    RNA-Seq可進(jìn)行全基因組水平的基因表達(dá)差異研究，具有定量更準(zhǔn)確、可重復(fù)性更高、檢測(cè)范圍更廣、分析更可靠等特點(diǎn)。除了分析基因表達(dá)水平，RNA-Seq還能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、SNP、剪接變體，并提供等位基因特異的基因表達(dá)。

    RNA-Seq的動(dòng)態(tài)范圍更廣，且假陽性可能更小，這意味著RNA-Seq的數(shù)據(jù)重復(fù)性應(yīng)當(dāng)比芯片要高。RNA-Seq能夠檢測(cè)樣品中的所有RNA，這對(duì)于鑒定細(xì)胞的新穎轉(zhuǎn)錄本來說是個(gè)優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)缺點(diǎn)在于，它檢測(cè)了總的RNA，而細(xì)胞中很大一部分RNA都來自核糖體和線粒體。這限制了其他RNA的讀取數(shù)量以及這些RNA表達(dá)水平的準(zhǔn)確性。因此，polyA RNA選擇和核糖體RNA去除等方法被開發(fā)出來，以便解決這個(gè)問題。

    然而，這些分離方法有可能會(huì)引入潛在誤差，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，第三代測(cè)序公司Helicos BioSciences的研究人員對(duì)操作方法修改后可能發(fā)生哪些差異進(jìn)行了研究，文章發(fā)表在最近一期的《PloS ONE》上。

    他們認(rèn)為，對(duì)于研究人員來說，必須了解以下幾點(diǎn)：技術(shù)差異如何影響結(jié)果的質(zhì)量和可解釋性，操作方法如何引入潛在誤差，RNA的來源如何影響轉(zhuǎn)錄檢測(cè)，以及所有這些差異如何影響得到的結(jié)論。

    Helicos BioSciences公司的研究人員使用了多個(gè)人RNA樣品，來評(píng)估RNA片段化、RNA分離、cDNA合成，單個(gè)以及多個(gè)標(biāo)簽計(jì)算。盡管采用polyA RNA選擇的操作方法得到了最多的非核糖體讀取，并能夠最精確測(cè)定編碼轉(zhuǎn)錄本，但研究人員發(fā)現(xiàn)這種方法只能檢測(cè)人細(xì)胞中的一部分非核糖體RNA.

    polyA RNA排除了數(shù)千個(gè)注釋的轉(zhuǎn)錄本以及更多未注釋的轉(zhuǎn)錄本，使得轉(zhuǎn)錄組查看不完全。而核糖體去除的RNA則提供了一個(gè)更經(jīng)濟(jì)的方法，來生成完整的轉(zhuǎn)錄組覆蓋。與多個(gè)標(biāo)簽相比，利用單個(gè)標(biāo)簽的表達(dá)測(cè)定具有評(píng)估基因表達(dá)和檢測(cè)短RNA的優(yōu)勢(shì)。

    這項(xiàng)工作有望幫助研究人員在分析基因表達(dá)時(shí)選擇適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。