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多肽鏈的降解:公衛(wèi)助理醫(yī)師備考

2012-08-03 16:33 醫(yī)學教育網(wǎng)
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2012年公衛(wèi)助理醫(yī)師考試即將在9月份開考,醫(yī)學教育網(wǎng)收集整理了公衛(wèi)執(zhí)業(yè)助理醫(yī)師考試基礎綜合的?贾R點,供各位考生參閱。

多肽鏈的氨基酸組成往往是比較復雜,因此直接分析多肽的氨基酸順序還是很困難的,多采用將多肽鏈進一步降解成為更小的片段,然后再行分析。肽鍵的裂解是一級結(jié)構(gòu)研究工作中的重要問題,它要求裂解點少,選擇性強,而且反應產(chǎn)率高,目前主要有化學法和酶解法兩類。

1)化學法

(1)溴化氰法 是最理想的化學方法,能選擇性斷裂甲硫氨酸所在的肽鍵

溴化氫化學降解法其優(yōu)點:

①一般蛋白質(zhì)含甲硫氨酸較少,由此可獲得大片段

②專一性強

③產(chǎn)率高達80%以上

④作用條件溫和,在室溫中用幾到十幾小時即可。

(2)部分酸水解法

Sanger在分析胰島素的一級結(jié)構(gòu)中采用了此法,即用0.1N鹽酸在110℃或用6N鹽酸在37℃水解。這種部分酸水解的方法特異性不強,因此對大片段的蛋白質(zhì)和肽均不合適。

(3)羥胺法

這種方法近十年來開始受人注意,羥胺能專一性地裂解AsnGly的肽鍵,酸性條件下裂解Asn-Pro肽鍵。已用于某些蛋白質(zhì)的分析。

(4)N-溴代琥珀酰亞胺法

主要裂解Try處的肽鍵,五十年代研究較多。但由于它也能斷裂TyrHis肽鍵,因此應用不廣。

2)酶解法

酶水解法較化學法具有更多的優(yōu)越性,使用也更廣泛。因其具有較高專一性,而且水解產(chǎn)率較高,所以可以選擇各種不同專一性的酶進行專一性的斷裂。

常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。

胰蛋白酶專一斷裂Lys,Arg的羧基側(cè)肽鍵,如果對Lys,Arg,CysH進行化學修飾可改變胰蛋白酶的斷裂性質(zhì)。

(1)賴氨酸的修飾。將Lys用順丁烯二酸酐或甲基順丁烯二酸桿修飾,則胰蛋白酶僅使Arg肽鍵斷裂。

順丁烯衍生物在中性pH下穩(wěn)定,胰蛋白酶水解僅使Arg鍵斷裂。在酸性條件下順丁烯衍生物可脫去封閉,此時再行胰蛋白酶水解,則得賴氨酸為末端的多肽。下述為蛋白質(zhì)中的賴氨酸,經(jīng)順丁烯;饔煤,被胰蛋白酶水解的例子。

(2)精氨酸的修飾。精氨酸與1,2-和1,3-二羰化合物作用,縮合產(chǎn)物是一雜環(huán)化合物,十分穩(wěn)定。然后胰酶水解僅斷裂賴氨酸殘基末端的肽鍵

(3)半胱氨酸的修飾。若肽鏈內(nèi)Lys、Arg均較少,則為了增加胰酶的裂解點,可以將半胱氨酸進行氨乙基化,其產(chǎn)物Sβ氨乙基半胱氨酸有類似Lys的結(jié)構(gòu),胰蛋白酶在水解時,不能識別這微細的變化,從而在半胱氨酸處斷裂。

蛋白水解酶的專一性

米源 主要作用點 其它作用點
胰蛋白酶 Arg,Lys  
糜蛋白酶 Tyr,Phe,Trp Leu,Met,His,Asu,Gln
彈性蛋白酶 Leu,Ile,Ala 其它等
胃蛋白酶 胃粘膜 Tyr,Phe,Trp,Met,Len Ala,Glu,Asp,其它等
木瓜蛋白酶 Papayplant木瓜植物 Arg,Lys,Gly 其它等
嗜熱菌蛋白酶 嗜熱解蛋白芽孢桿菌 Leu,Ile,Phe Val,Tyr
枯草桿菌蛋白酶 枯草桿菌 芳香族及脂肪族殘基

肽鏈的裂解和重組大致有三種情況:一種是非特異性裂解,如酸水解。由于裂解的片段較小,造成分離的困難。因此這種非特異性裂解對大分子肽鏈是不適用的。第二種是特異性裂解,采用兩種以上的專一裂解,然后進行組合,這種方法一般也適用于分子量小于5萬的蛋白質(zhì)。第三種是逐步的專一裂解,首先將某種氨基酸進行化學修飾,使水解酶專一斷裂某一種氨基酸,分成若干片段,然后解除化學封閉,再用此酶裂解,使曾被封閉過的氨基酸斷裂。目前傾向于采用這種裂解方式。

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