【摘要】目的：進(jìn)一步了解急性呼吸道感染中流感嗜血桿菌（HI）感染的發(fā)病情況。方法：采用單克隆抗體夾心酶聯(lián)免疫吸咐法，對(duì)36例上呼吸道感染、32例支氣管炎、70例肺炎患兒及45例健康對(duì)照組的血、尿進(jìn)行b型HI外膜蛋白（HiboMP）抗原的檢測(cè)，并對(duì)70例肺炎患兒的血清進(jìn)行HibOMP抗體檢測(cè)。結(jié)果36例上呼吸道感染患兒中有4例為HibOMP抗體陽(yáng)性，32例支氣管肺炎患兒中有4例陽(yáng)性，70例肺炎患兒中有18例為陽(yáng)性；45例健康對(duì)照組中僅1例為HibOMP抗原陽(yáng)性。肺炎組抗原檢出率高于對(duì)照組（c2=10.960，P〈0.01）。70例肺炎中18例HiboMP抗體陽(yáng)性。抗原、抗體檢測(cè)共有24例（包括抗原、抗體均陽(yáng)性12例，僅抗原或抗體陽(yáng)性各6例）肺炎獲得陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)論11.1%的上呼吸道感染、12.5%支氣管炎和34.3%的肺炎患兒為Hib感染；抗原、抗體聯(lián)合檢測(cè)可使Hib檢出率提高。

　　流感嗜血桿菌（Hemophilusinfluenzae，HI）是急性呼吸道感染（ARI）中最常見的細(xì)菌病原之一。1984年報(bào)道HI在發(fā)展中國(guó)家小兒急性下呼吸道感染（ALRI）中分離率高達(dá)45%［1］，近年來(lái)，發(fā)展中國(guó)家報(bào)道HI所致的ARI并不少見［2，3］。國(guó)內(nèi)對(duì)ARI的細(xì)菌病原學(xué)研究相對(duì)薄弱，有關(guān)在ARI中HI感染的發(fā)病情況尚缺乏確切的流行病學(xué)資料。為此，我們進(jìn)行了ARI（包括上呼吸道感染、支氣管炎、肺炎）中b型流感嗜血桿菌（Hib）致病情況的研究。

　　對(duì)象和方法

　　一、研究對(duì)象

　　依制訂的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，于1994年12月～1995年5月，在北京兒童醫(yī)院病房和門診選擇5歲以下（新生兒除外）、起病1周以內(nèi)的ARI患兒138例。其中，肺炎（包括6例毛細(xì)支氣管炎）70例，平均年齡1歲6月（2月～5歲）；支氣管炎32例，平均年齡為1歲10月（3個(gè)月～5歲）；上呼吸道感染36例，平均年齡為2歲（5個(gè)月～5歲）。138例患兒中男91例，女47例。患兒組取血前均用抗生素超過(guò)24小時(shí)。同時(shí)選擇45例5歲以下（新生兒除外）健康兒童為對(duì)照組，男24例，女21例，平均年齡為2歲（4個(gè)月～5歲）。

　　二、標(biāo)本的收集和處理

　　1.血：于入院當(dāng)時(shí)或門診初診時(shí)經(jīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作抽取受檢者靜脈血3ml，放入含有30～50mlHI特殊培養(yǎng)基的瓶?jī)?nèi)。并立即轉(zhuǎn)至CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。同時(shí)取2ml靜脈血離心，留血清置-30℃冰箱內(nèi)保存待檢。出院時(shí)留第2份血清。第1份血清均取自發(fā)病3～7天（平均4天），第2份血清取自起病的2～3周。雙份血清間隔時(shí)間為7～14天（平均12天）。

　　2.咽分泌物：于入院當(dāng)時(shí)或門診初診時(shí)取受檢者咽后壁和兩側(cè)扁桃體區(qū)分泌物，放入含X、V因子的培養(yǎng)基肉湯中做咽分泌物培養(yǎng)［5］。標(biāo)本在1小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)入CO2孵箱內(nèi)，增菌16～18小時(shí)，增菌液變混濁后轉(zhuǎn)種至培養(yǎng)皿。

　　3.尿：收集入院24小時(shí)內(nèi)或初診當(dāng)天的尿液30～50ml，置透析袋內(nèi)用聚乙二醇濃縮25～50倍，置-30℃冰箱保存待檢。

　　三、實(shí)驗(yàn)方法

　　1.細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定：用含有Levinthol原液的特殊HI培養(yǎng)基進(jìn)行咽分泌物、血細(xì)菌培養(yǎng)，對(duì)所得可疑的透明菌落進(jìn)一步分純，以衛(wèi)星試驗(yàn)及X、V因子需要試驗(yàn)來(lái)鑒定HI.進(jìn)一步血清分型采用Hib抗血清、a～f多價(jià)抗血清。若與Hib抗血清凝集者為Hib菌株。

　　2.Hib外膜蛋白（OMP）抗原檢測(cè)法：采用兩種單克隆抗體夾心的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)HibOMP抗原。由于單克隆抗體P2-18可識(shí)別到目前為止所有的HI，且親和力較強(qiáng)［6］；P2-4僅可識(shí)別Hib菌株［7，8］。兩種針對(duì)不同抗原決定簇的單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用可提高檢測(cè)的敏感性。因此，選用P2-18作為包被抗體，P2-4作為酶標(biāo)抗體。對(duì)受檢者的血、尿進(jìn)行檢測(cè)。血或尿任一陽(yáng)性即為Hib感染證據(jù)。

　　3.HibOMP抗體測(cè)定：采用Scarcosyl方法提取Hib菌的外膜蛋白，以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株6880的OMP與臨床分離株C44的OMP進(jìn)行混合作為包被抗原，用間接ELISA法測(cè)定其特異性抗體IgG、IgM.以急性期血清抗體IgM水平高于同年齡±2s及雙份血清抗體3倍以上增高為產(chǎn)生抗體反應(yīng)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)?？乖蚩贵w反應(yīng)任一陽(yáng)性即為Hib感染。

　　結(jié)果

　　一、Hib細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

　　138例ARI患兒中無(wú)1例血培養(yǎng)分離出Hib，咽分泌物培養(yǎng)在對(duì)照組與患兒組之間Hib的分離率的差異無(wú)顯著意義（c2=1.039，P＞0.05）。

　　二、HibOMP抗原檢測(cè)結(jié)果

　　經(jīng)c2檢驗(yàn)，各組間HiboMP抗原檢出率的差異具非常顯著意義（c2=12.814，P〈0.01），兩兩比較，肺炎組與對(duì)照組的HibOMP抗原檢出率的差異具有顯著意義（c2=10.960，P〈0.01）。

　　三、HibOMP抗體測(cè)定的結(jié)果

　　70例肺炎患兒中有19例測(cè)出了HibOMP抗體，除1例查出非b型的HI抗原系交叉反應(yīng)所致外，余18例（25.7%）可確證為Hib感染，其中12例同時(shí)檢出HiboMP抗原，6例未查到HibOMP抗原。

　　結(jié)合抗原、抗體測(cè)定的結(jié)果，24例肺炎患兒確定了Hib感染的診斷（34.3%，包括抗原、抗體共同陽(yáng)性12例，僅HibOMP抗原和HibOMP特異抗體反應(yīng)陽(yáng)性各6例）。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　討論

　　HI和肺炎鏈球菌既是呼吸道的正常菌群，又是ARI的最常見的致病菌。因而，咽分泌物培養(yǎng)不能代表下呼吸道感染的致病菌。痰標(biāo)本在5歲以內(nèi)小兒又不易獲得。血培養(yǎng)特異性強(qiáng)，敏感性差，ARI時(shí)很難得到陽(yáng)性的血培養(yǎng)結(jié)果。本組138例ARI中無(wú)1例血培養(yǎng)分離出HI，可能與取血前受檢者均用過(guò)抗生素致細(xì)菌死亡有關(guān)。細(xì)菌抗原檢測(cè)為ARI的細(xì)菌病原學(xué)診斷提供了新的途徑。與血培養(yǎng)相比其敏感性較高。單克隆抗體使其特異性大大提高［9］。我們應(yīng)用兩種識(shí)別不同抗原位點(diǎn)的單克隆抗體建立了雙抗體夾心的ELISA方法，其檢測(cè)各種ARI中HibOMP抗原的檢出率依次為：上呼吸道感染為11.1%，支氣管炎為12.5%，肺炎25.7%，以肺炎的為最高。而健康對(duì)照組僅2.2%.表明Hib感染在小兒肺炎中占重要地位。

　　如果抗原、抗體聯(lián)合檢測(cè)，70例肺炎患兒中24例（34.3%）體內(nèi)存在Hib感染的證據(jù)，因此，聯(lián)合抗原、抗體測(cè)定可進(jìn)一步提高呼吸道感染患兒中Hib感染的檢出率。

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