【摘要】為評(píng)價(jià)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法和Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)單采血小板中殘留白細(xì)胞，應(yīng)用系列的稀釋實(shí)驗(yàn)研究其準(zhǔn)確性；對(duì)已知白細(xì)胞濃度的同一樣本，反復(fù)檢測(cè)14次，研究其重復(fù)性；分別用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法和Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)102份去白細(xì)胞的單采血小板樣本，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白細(xì)胞濃度為0.8＜WBC/μl＜10時(shí)，兩方法無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論：兩種方法均可用于少白細(xì)胞成分的質(zhì)量控制。

　　【關(guān)鍵詞】血小板單采

　　近年來，大力提倡和開展成分獻(xiàn)（輸）血，尤其是單采血小板。近代醫(yī)學(xué)研究表明，血液中非治療性成分如白細(xì)胞等是一種“污染物”，去除單采血小板樣品中白細(xì)胞的污染不僅可以降低非溶血性輸血反應(yīng)［1］、巨細(xì)胞病毒等嗜白細(xì)胞病毒的傳播［2］，還可以減少HLA同種異體免疫反應(yīng)［3］（血小板輸注無效、移植物抗宿主病等）。國(guó)際上，已將引起HLA同種異體免疫反應(yīng)的白細(xì)胞污染量控制在5×106以下［4］。這已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了現(xiàn)有傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法的檢測(cè)限。近幾年，已經(jīng)報(bào)道了很多種低濃度白細(xì)胞的計(jì)數(shù)方法［5］，其中Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法應(yīng)用最廣［6-8］。我們對(duì)這兩種低濃度白細(xì)胞污染的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行了應(yīng)用和評(píng)價(jià)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

　　材料和方法

　　儀器與試劑　流式細(xì)胞計(jì)數(shù)：FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BDIS產(chǎn)品）、LeucoCOUNT試劑（BDIS產(chǎn)品）和TruCOUNT磁珠管（BDIS產(chǎn)品）。Nageotte計(jì)數(shù)盤（HausserScientificHorsham，USA產(chǎn)品）。血小板單采機(jī)：MCS+Haemonetics與Spectra，COBELaboratories.白細(xì)胞定值樣本：由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院與浙江省人民醫(yī)院提供。

　　樣本收集　浙江省血液中心無償獻(xiàn)血者去白細(xì)胞單采血小板，共102份，留樣后24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。

　　流式細(xì)胞計(jì)數(shù)　將100μl樣品加入到已知數(shù)量的TruCOUNT磁珠管中，再加入400μl試劑，輕搖，室溫暗置30分鐘，混勻后計(jì)數(shù)1.0×104磁珠中PI染色的白細(xì)胞數(shù)。利用以下公式計(jì)算白細(xì)胞濃度：WBC/μl=（白細(xì)胞數(shù)/104）×TruCOUNT總磁珠數(shù)/樣品體積（100μl）醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)　樣品5倍稀釋，充池后加蓋靜置30分鐘，普通光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)1個(gè)大方格（50μl）內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)（n）。利用以下公式計(jì)算白細(xì)胞濃度：WBC/μl=（n/50）×5=n/10

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±D）表示，統(tǒng)計(jì)處理采用MicrosoftExcel軟件，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　結(jié)果

　　準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)　已知白細(xì)胞濃度的樣品通過1/10系列稀釋（0.1-10.0WBC/μl），每份標(biāo)本分別用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法（A）和Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法（B）平行檢測(cè)。將測(cè)定值與預(yù)期值配對(duì)回歸分析，得到相關(guān)系數(shù)（r）、斜率和截距。當(dāng)0.1＜WBC/μl＜0.7時(shí)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法的測(cè)定值和預(yù)期值呈直線相關(guān)，y=0.99x+0.01，r=0.99（P＜0.001），Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定值比預(yù)期值持續(xù)偏低，y=1.07x-0.21，相關(guān)性差，r=0.90；當(dāng)0.8＜WBC/μl＜10.0時(shí)，兩方法的直線回歸分別為A：y=1.01x-0.02，B：y=0.99x-0.07，測(cè)定值和預(yù)期值呈直線相關(guān)r=0.99（P＜0.001），準(zhǔn)確性高。

　　重復(fù)性評(píng)價(jià)　白細(xì)胞濃度為4.0/μl的同一樣本，分別用兩種方法重復(fù)檢測(cè)14次，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法白細(xì)胞均值為4.07/μl，95%可信區(qū)間為3.51-4.63/μl；Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法白細(xì)胞均值為3.91/μl，95%可信區(qū)間為3.27-4.55/μl。兩方法的14次檢測(cè)結(jié)果均在95%可信區(qū)間內(nèi)，重復(fù)性高（CV＜10%）結(jié)果見表1。Table 1. Interassay coefficient of variation for 14 replications of a sample with a mean leukocyte concentration of 4/μl（略）　　

　　應(yīng)用性評(píng)價(jià)　分別用兩種方法同時(shí)檢測(cè)102份去除白細(xì)胞的單采血小板樣品，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)白細(xì)胞均值為1.12/μl；Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)白細(xì)胞均值為1.10/μl，所有檢測(cè)結(jié)果均在95%可信區(qū)間內(nèi)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩方法無顯著差異（P>0.05），結(jié)果見表2.Table 2. Comparison of results obtained by　flow cytometry and Nageotte method （略）醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　討論

　　由于白細(xì)胞去除技術(shù)的不斷發(fā)展，低濃度白細(xì)胞檢測(cè)也面臨更新的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)的全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)精度＞100/μl［9，10］；Neubauer計(jì)數(shù)池精度為2.8-5.6/μl；Nageotte計(jì)數(shù)池與流式儀的精度均可達(dá)到0.05-0.1/μl，當(dāng)白細(xì)胞數(shù)<0.8/μl，Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法一樣，其測(cè)定值和預(yù)期值呈直線相關(guān)，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好（CV＜10%），檢測(cè)102份樣本，兩者并無顯著差異?；谝陨辖Y(jié)果，本研究肯定了Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法在相應(yīng)檢測(cè)限內(nèi)高度的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。Wenz［10］與Kao等［11］也發(fā)現(xiàn)，Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯比傳統(tǒng)方法準(zhǔn)確可靠，與流式細(xì)胞計(jì)數(shù)相比，具有不需要特殊的儀器和試劑、簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適合于血站系統(tǒng)血液成分白細(xì)胞污染的常規(guī)質(zhì)量控制［12］。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　1　Wenz B，Gurtlinger KF，O′ Toole AM，et al. Preparation of gra- nulocyte-poor red cells by microaggregate filtration：a simplified method to minimize febrile transfusion reaction. Vox Sang，1980； 39： 282-287

　　2　Gilbert GL，Hayes K，Hudson IL，et al. Prevention of transfusion-acquired cytomegalovirus infection in infants by blood filtration to remove leucocytes. Neonatal Cytomegalovirus Infection Study Group. Lancet，1989； 1： 1228-1231

　　3　Sniecinski I，O′ Donnell MR，Nowicki B，et al. Prevention of refractoriness and HLA-alloimmunization using filtered blood pro- ducts. Blood，1988； 71： 1402-1407

　　4　Fisher M，Chapman JR，Ting A，et al. Alloimmunization to HLA antigens following transfusion with leukocyte-poor and purified platelet suspensions. Vox Sang，1985； 49： 331-335

　　5　Dzik S. Principles of counting low numbers of leukocytes in leuko reduced blood components.Transfus Med Rev，1997； 11： 44-55

　　6　Lutz P，Dzik WH. Large volume hemocytometer chamber for accurate counting of white cells（WBCs） in WBC-reduced platelets：validation and application for quality control of WBC- reduced platelets prepared by apheresis and filtration. Transfusion，1993； 33： 409-412

　　7　Masse M，Naegelen C，Pellegrini N，et al. Validation of a simple method to count very low white cell concentrations in filtered RBCs or platelets，Transfusion，1992； 32： 565-571

　　8　Vengelen-Tyler V. Technical manual. Bethesda： American Association of Blood Banks. 1996： 722-725

　　9　Kjeldsberg CR，Knight JA. Body fluids： laboratory examination of amnionic，cerebrospinal，seminal，serous，and synovial fluids. In Laboratory methods. Chicago： American Society of Clinical Pathologists. 1986： 154-155

　　10　Wenz B，Besso N. Quality control and evaluation of leukocyte-depleting filters. Transfusion，1989； 29： 186-187

　　11　Kao KJ，Scornik JC. Accurate quantitation of the low numbers white cells in white cell-depleted blood components. Transfusion，1989； 29： 774-778

　　12　Rebulla P，Dzik WH. Multicenter evaluation of methods for counting residual white cell in white cell-depleted red blood cells. The Biomedical Excellence for Safe Transfusion （BEST） Working Party of the International Society of Blood Transfusion. Vox Sang，1994； 66： 25-32