【摘要】  目的：觀察聚己內酯（PCL）電紡纖維支架材料對骨髓基質細胞（BMSCs）增殖及分化特點的影響，評價其作為骨組織工程的支架材料的應用前景。 方法： 將兔BMSCs與PCL電紡纖維支架材料在培養(yǎng)板內共培養(yǎng)。 采用形態(tài)學觀察、MTT法及ALP檢測等方法檢測BMSCs在PCL電紡纖維表面的粘附、增殖和分化能力。 結果： 體外培養(yǎng)的BMSCs能在PCL電紡纖維表面正常粘附和增殖，并且表達較高的堿性磷酸酶活性。 結論： PCL電紡纖維適合作為支架材料應用于BMSCs為種子細胞的組織構建。

　　【關鍵詞】  電紡纖維；聚己內酯；骨髓基質細胞

　　0引言

　　理想的組織工程支架材料要求其不但能夠作為種子細胞體內擴增和增殖的支架，而且應當能夠成為生長因子、生物活性物質和基因的生物載體，發(fā)揮細胞功能調節(jié)的作用［1］。 目前已有近百種聚合物成功的通過這一技術獲取了超細纖維并被陸續(xù)應用于膜技術、增強材料、紡織品、光學傳感器、醫(yī)藥釋放體系以及組織工程支架材料制備等諸多領域 ［2］。 本研究旨在通過聚己內酯（polycaprolactone， PCL）電紡纖維支架材料對兔骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells， BMSCs）生長、增殖和功能分化作用的研究，初步探討PCL電紡纖維作為組織工程支架材料的應用前景。

　　1材料和方法

　　1.1材料聚己內酯（PCL，美國Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化學試劑公司）；氯仿（西安化學試劑公司）；BGG40/2高壓直流電源（北京機電研究所，030KV）；JSM6700F型掃描電鏡（日本JEOL公司）；BX60型熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）；1.5 mo齡新西蘭幼兔1只，雄性，體質量1.5 kg （第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco BRL公司）；胎牛血清（浙江金華清湖犢牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦東生化試劑廠）；MTT（美國Sigma公司）；PholloidinFITC（美國Sigma公司）；堿性磷酸酶（alkaline Phosphatase，ALP）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2方法

　　1.2.1PCL電紡纖維支架的制備以氯仿/DMF（體積比2∶1）的混合溶液為溶劑，配制濃度為80 g/L的PCL電紡絲溶液。 將電紡絲溶液加入一個安裝有8號不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管。 針頭即噴絲口與BGG40/2高壓直流電源的正極相連，針頭下方安裝一個接地的銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏與高壓直流電源的負極相連。 在外加電壓10 kV，接收距離12 cm，電紡絲溶液流量為3 mL/h的條件下進行靜電紡絲。 收集接收屏表面獲得的縱橫交錯的無紡纖維氈，置于干燥器中干燥保存。

　　1.2.2兔BMSCs的原代培養(yǎng)與接種取新西蘭幼兔四肢長骨，縱行剖開，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，靜置后取上清進行培養(yǎng)BMSCs. 24 h后換液，去除未貼壁的血細胞。 每3 d換液1次，2.5 g/L胰酶常規(guī)消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。 取第二代生長良好的BMSCs，胰酶消化傳代。 實驗分組為PCL電紡纖維實驗組和細胞培養(yǎng)板對照組兩組。 將傳代培養(yǎng)的第二代BMSCs以4×104/cm2濃度接種于各組，每孔加入500 μL接種細胞液，置入細胞培養(yǎng)箱4 h，再加入500 μL培養(yǎng)液，50 mL/L CO2， 飽和濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

　　1.2.3肌動蛋白actin直接免疫熒光染色培養(yǎng)8 h后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍。 37 mL/L甲醛的PBS溶液固定5 min， PBS洗滌2遍。 丙酮脫水，1 mL/L TritonX100滲透5 min. 10 mg/L PholloidinFITC 37℃孵育染色40 min，抗熒光淬滅液封片。 于365 nm熒光顯微鏡下觀察記錄。

　　1.2.4掃描電鏡觀察于培養(yǎng)3 d后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍，25 mL/L戊二醛固定24 h. 乙腈梯度脫水，10 g/L鋨酸處理1 h，臨界點干燥，離子濺射儀噴金。 導電膠固定，以冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察，電子加速率為5 kV.

　　1.2.5MTT檢測于培養(yǎng)1，3，5，7 d后向實驗各組分別加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM終止消化。 500 g離心10 min，每管重新加入DMEM培養(yǎng)液200 μL，接種至96孔培養(yǎng)板。 每組4孔，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h. 在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔A490 nm值，每組3個試件。

　　1.2.6ALP活性檢測培養(yǎng)的第3，7， 14日后，向實驗各組分別加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM終止消化。 將每個樣本的細胞懸液加入離心管，500 g離心10 min. 每管加入200 μL細胞裂解液，充分吹打混合。 轉移至96孔培養(yǎng)板，加入0.1 mL/L Triton X100 50 μL，4℃過夜。 采用ALP檢測試劑盒，每孔加入ALP反應底物100 μL，37℃孵育30 min. 0.2 mol/L NaOH 50 μL終止反應，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔A410 nm值，每組3個試件。

　　統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用統(tǒng)計學軟件SPSS 10.0進行方差分析。

　　2結果

　　2.1形態(tài)學觀察接種8 h后BMSCs在PCL電紡纖維材料表面的actin直接免疫熒光染色， BMSCs細胞以梭形和長方形為主，邊緣有弧度，胞質豐滿、偽足伸展充分。 細胞胞質內含大量束狀排列的微絲結構，向兩端伸展，排列有序。 核周圍染色加深，呈圓形或卵圓形的細胞核（圖1）。 掃描電鏡下示BMSCs伸展更加充分，生長連接成片。 BMSCs下可見PCL電紡纖維呈相互交聯(lián)的多孔網(wǎng)狀無紡結構，纖維交錯相疊、光滑均一、結構疏松、孔隙結構密集，纖維直徑在153～612 nm之間（圖2）。

　　2.2MTT檢測經(jīng)方差分析，PCL電紡纖維實驗組與對照組的A490 nm值均隨共培養(yǎng)時間的增加而增大（表1），7 d>5 d>3 d>1 d，各檢測時間點之間有顯著性差異（P<0.05）；而在1，3，5，7 d各檢測時間點，兩組吸光度之間無顯著差異（P>0.05）。表1聚己內酯電紡纖維支架對骨髓基質細胞增殖的影響（略）

　　2.3ALP活性檢測經(jīng)方差分析，PCL電紡纖維實驗組與對照組的吸光度A值均隨共培養(yǎng)時間的增加而增大（表2），14 d>7 d>3 d，各檢測時間點之間有顯著性差異（P<0.05）；而在3，7，14 d各檢測時間點，兩組吸光度之間無顯著差異（P>0.05）。表2聚己內酯電紡纖維支架對骨髓基質細胞ALP活性的影響（略）

　　3討論

　　種子細胞與支架材料是組織工程研究的兩個核心問題。 骨髓來源的BMSCs具有多向轉化的潛能，通過生長因子的誘導，可以分化為成骨細胞，在骨組織的修復、改建以及愈合過程中發(fā)揮重要的作用，是目前最為合適的骨組織工程種子細胞［3］。 PCL是由ε己內酯開環(huán)聚合所得到的線性脂肪族聚酯，具有良好的熱穩(wěn)定性、生物降解性、力學性能、藥物通過性以及生物相容性。 其降解產(chǎn)物對人體無毒，目前也廣泛的應用于骨折固定材料、手術縫線、醫(yī)用敷料、藥物控釋和組織工程支架材料等領域［4-5］。 利用靜電紡絲技術制備組織工程支架材料的優(yōu)勢在于：能夠制備出比表面積大、孔徑小、孔隙率高、纖維均一性好，直徑與細胞外基質內膠原纖維相近的連續(xù)超細纖維（50～500 nm），從而最大程度的模仿細胞外基質天然結構；制備方法簡單快捷，支架材料可以是單一的聚合物，也可以是多種聚合物的復合體，并可以在支架中引人無機粒子（如羥基磷灰石等）、生長因子甚至活細胞等； 通過選擇適當?shù)牟牧虾图庸?shù)，能夠調控支架材料的孔隙率、厚度、三維結構、降解率和力學性能；利用同軸電紡技術還能夠將生物活性分子加入到聚合物支架中，實現(xiàn)有效釋放［5-7］。

　　實驗中所制備的PCL電紡纖維大體外觀光滑均一，纖維直徑為153～612 nm，為納米級多孔無紡纖維。 其相互交錯的多孔結構與天然細胞外基質的膠原纖維結構近似，有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。 細胞內肌動蛋白actin 的結構在維持細胞形狀及附著方面起著非常重要的作用，actin染色通常用來研究細胞在材料表面的移動、伸展及形態(tài)。 Actin直接免疫熒光染色結果顯示BMSCs能夠在PCL電紡纖維表面形成早期附著。 掃描電鏡觀察進一步表明生長在PCL電紡纖維材料表面的BMSCs不但可以早期貼附與材料表面，并且能夠在短時間內形成良好的鋪展形態(tài)。 MTT比色法試驗能夠檢測細胞存活和生長。 我們的結果表明BMSCs能夠在PCL電紡纖維表面正常的存活和增殖，并且同對照組一樣具有較旺盛的增殖能力，生物相容性良好。 ALP是成骨細胞分化和功能成熟的早期標志，在成骨細胞趨向成熟的轉化限制點扮演重要角色。 測定成骨細胞內ALP活性的變化可以了解成骨細胞的分化成熟程度以及細胞成骨礦化的能力。 我們的結果表明隨著時間的增加PCL電紡纖維表面的BMSCs同對照組一樣，持續(xù)的保持著成熟分化功能，表達出完善的成骨活性。

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