【摘要】  目的：探討脈沖電磁場(chǎng)（PEMFs）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSCs）的影響。 方法：用全骨髓貼壁法分離rMSCs，對(duì)其進(jìn)行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖水平，檢測(cè)堿性磷酸酶活性，進(jìn)行四環(huán)素?zé)晒馊旧外}結(jié)節(jié)染色。 結(jié)果：rMSCs經(jīng)PEMFs刺激后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖水平均有不同程度提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中1 Hz，0.4 mT組改變最為明顯（3 d，0.323±0.051；5 d，0.714±0.058），對(duì)照組（3 d，0.246±0.044；5 d，0.487±0.064），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；堿性磷酸酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組水平升高（5 d，0.348±0.032；15 d，2.339±0.034），對(duì)照組（5 d， 0.205±0.026；15 d，0.533±0.013），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 四環(huán)素?zé)晒馊旧外}結(jié)節(jié)染色結(jié)果均呈陽(yáng)性。 結(jié)論：rMSCs經(jīng)PEMFs刺激后，能促進(jìn)體外培養(yǎng)rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁場(chǎng)參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。

　　【關(guān)鍵詞】  脈沖電磁場(chǎng)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；成骨細(xì)胞

　　0引言

　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中，具有自我更新能力和多向分化潛能，免疫原性弱［1-3］。 脈沖電磁場(chǎng)（pulsed electromagnetic fields，PEMFs） 能夠促進(jìn)活細(xì)胞增殖及分化，刺激骨局部因子的產(chǎn)生，改善骨密度和生物力學(xué)特性［4］，用于骨折延遲愈合、骨不連、骨質(zhì)疏松癥等骨科疾病［5］。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者在這方面開(kāi)始了大量研究工作，認(rèn)為MSCs經(jīng)12 Hz，1.1 mT的PEMFs合理刺激后，細(xì)胞增殖加速，符合成骨細(xì)胞的形態(tài)特征和生物學(xué)特性［6］。 利用恒磁場(chǎng)作用于骨組織中細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)恒磁場(chǎng)處理可以促進(jìn)MSCs向成骨方向分化［7］。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察rMSCs在低頻率PEMFs的作用下增殖水平變化和細(xì)胞分化情況，以了解不同參數(shù)的PEMFs對(duì)rMSCs產(chǎn)生的影響。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　SD仔鼠，12～15 d，體質(zhì)量30～35 g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 骨愈合刺激儀（第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系研制，ZL.0224739.4），治療頻率為15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；胰蛋白酶，茜素紅S（美國(guó)Sigma公司）；鹽酸四環(huán)素膠囊（西安利君制藥股份有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）。

　　1.2方法

　　1.2.1rMSC的體外分離培養(yǎng)

　　斷頸處死大鼠，無(wú)菌條件下取其股骨和肱骨。 在PBS中將骨剪成1～2 mm3的小塊，100目篩網(wǎng)過(guò)濾后移入離心管中，1200 rpm離心5 min，棄上清，重懸浮于4 mL低糖DMEM中。 72 h后換液。

　　1.2.2rMSCs生物學(xué)特性鑒定

　　進(jìn)行PAS過(guò)碘酸雪夫氏染色、油紅O染色和堿性磷酸酶（ALP）染色。

　　1.2.3rMSCs生長(zhǎng)曲線的繪制

　　將原代細(xì)胞以5×106 cells/孔接種在24孔板上，第4日開(kāi)始，每日消化3個(gè)孔，分別計(jì)數(shù)，求平均值繪制生長(zhǎng)曲線。 將第3代細(xì)胞以1×104 cells/孔接種在24孔板上，第2日開(kāi)始以同上方法繪制生長(zhǎng)曲線。

　　1.2.4刺激方法

　　PEMFs發(fā)生儀頻率：15 Hz，1 Hz；磁感應(yīng)強(qiáng)度：0～0.8 mT可調(diào)；線圈直徑：200 mm. 調(diào)整兩線圈距離至100 mm. 將線圈放置在孵箱中，刺激時(shí)將細(xì)胞放置在兩線圈中間位置。 調(diào)整需要的強(qiáng)度和頻率，刺激結(jié)束后，將對(duì)照組放在同樣位置相同時(shí)間。 刺激時(shí)間為每次3 h，1次/d.

　　1.2.5MTT法檢測(cè)

　　細(xì)胞增殖將rMSCs以1×104 cells/mL接種于7個(gè)96孔板中，每板接種32孔。 刺激方式為：T0組（對(duì)照組）；T1組（15 Hz，0.2 mT）；T2組（15 Hz，0.4 mT）；T3組（15 Hz，0.8 mT）；T4組（1 Hz，0.2 mT）；T5組（1 Hz，0.4 mT）；T6組（1 Hz，0.8 mT），連續(xù)作用5 d. 接種第2日開(kāi)始PEMFs作用。 第3日每板選擇16孔，加MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，測(cè)定490 nm波長(zhǎng)時(shí)各孔的吸光度A值。 第5日對(duì)其余孔做同樣檢測(cè)。

　　1.2.6ALP活性檢測(cè)

　　將rMSCs以每孔1×104 cells/mL接種于6個(gè)24孔板中，每板接種8孔，分為2組，每組3個(gè)板。 刺激方式為：T0組（對(duì)照組），T1組（1 Hz，0.4 mT）。 接種第2日開(kāi)始PEMFs刺激，連續(xù)刺激15 d. 第3日選兩個(gè)板，測(cè)定ALP活性。 第5日和第15日各檢測(cè)2個(gè)板。

　　1.2.7四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記

　　將rMSCs以3×104 cells/mL接種于2個(gè)6孔板中，分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。 第2日開(kāi)始對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行PEMFs刺激，每天刺激結(jié)束后，關(guān)閉儀器電源，將對(duì)照組放在相同位置相同時(shí)間。 培養(yǎng)18 d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記。 熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

　　1.2.8鈣結(jié)節(jié)染色

　　將rMSCs以5×104 cells/mL接種于2個(gè)6孔板中，分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。 接種第2日開(kāi)始PEMFs作用，對(duì)照組處理同前。 28 d后，用茜素紅S染液進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色。 倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用SNKq檢驗(yàn)和方差分析。 以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1形態(tài)學(xué)觀察及生物學(xué)鑒定

　　接種前3 d可見(jiàn)大量大小不一，圓形懸浮細(xì)胞。 第5日大部分細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，第7日后，可見(jiàn)梭形細(xì)胞，部分形成集落，排列呈規(guī)則的輻射狀。 經(jīng)2～3次純化處理，細(xì)胞形態(tài)趨于單一化，以梭形、三角形為主，呈集落生長(zhǎng)趨勢(shì)（圖1）。 染色結(jié)果均為陰性，說(shuō)明細(xì)胞不能分泌糖原、未向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化。

　　2.2rMSCs生長(zhǎng)曲線的繪制

　　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形，具有穩(wěn)定的潛伏期、對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。 可見(jiàn)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)周期明顯比原代細(xì)胞短（圖2）。

　　2.3PEMFs對(duì)rMSCs增殖水平的影響

　　PEMFs刺激3 d后，T1，T2，T4與對(duì)照組A值分別為0.265±0.063，0.260±0.059，0.266±0.057和0.246±0.044，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 T3，T5和T6組A值分別為0.288±0.060，0.323±0.051和0.300±0.042，與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），以T5最為明顯。 PEMFs刺激5 d后，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），T5，T6和對(duì)照組A值分別為0.714±0.058， 0.720±0.069和0.487±0.064，組間差異比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

　　2.4ALP活性檢測(cè)經(jīng)

　　PEMFs刺激后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組A值3 d為0.225±0.017和0.185±0.025，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；5 d為0.348±0.032和0.205±0.026，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；15 d為2.339±0.034和0.533±0.013，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

　　2.5四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記

　　細(xì)胞8 d左右呈梭形分布，并出現(xiàn)融合，約16 d左右出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀物。 繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)復(fù)層生長(zhǎng)。 持續(xù)培養(yǎng)，中心出現(xiàn)圓形細(xì)胞結(jié)節(jié)。 培養(yǎng)21 d時(shí)，尚無(wú)明顯鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn)。 但四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記后，鏡下細(xì)胞周圍基質(zhì)聚集區(qū)呈明亮的黃色熒光區(qū)，陽(yáng)性面積約占（10.1±1.2）%；對(duì)照組陽(yáng)性面積約占（2.3±0.7）%. 兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖3）。

　　2.6鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果

　　持續(xù)培養(yǎng)32 d后進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色，可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)成橘紅色，大小、形態(tài)各不相同，邊界清晰，呈火山狀突起，中間有黑色不透光顆粒，周圍為橘紅色，由中間向周邊顏色逐漸變淺，陽(yáng)性面積約占（15.3±0.6）%；對(duì)照組陽(yáng)性面積約占（9.6±0.8）%. 兩者之間有顯著差異（P<0.01，圖4）。

　　3討論

　　本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓貼壁法，在沖洗骨髓腔時(shí)某些滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞因子會(huì)同時(shí)被沖出，與MSCs一同培養(yǎng)，可促使MSCs生長(zhǎng)增殖旺盛，活力相對(duì)較強(qiáng)。 目前該類方法通常采用的是成年大鼠，雖然成年大鼠可以獲得較多的骨髓量，操作也相對(duì)方便，但成年大鼠體內(nèi)MSCs的含量更少，增殖能力也較年幼的動(dòng)物差，為此，我們采用了12～15 d的大鼠。 根據(jù)生長(zhǎng)曲線，選取3～4 d的傳代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T5組可以顯著提高rMSCs增殖水平，提示該刺激參數(shù)可能是PEMFs刺激MSCs生長(zhǎng)與增殖的一個(gè)“窗口”。 本實(shí)驗(yàn)中，PEMFs作用3 d后，T1，T2，T4組均未能表現(xiàn)出提高細(xì)胞增殖水平的作用，但在作用5 d后，各組細(xì)胞增殖水平均有提高，說(shuō)明對(duì)于不同的頻率和場(chǎng)強(qiáng)，細(xì)胞需要不同的刺激時(shí)間，才可以對(duì)PEMFs產(chǎn)生有效的反應(yīng)。 倒置相差顯微鏡下觀察到經(jīng)PEMFs作用的rMSCs體積明顯較對(duì)照組大，細(xì)胞增殖能力旺盛，傳代周期明顯縮短，培養(yǎng)2～3 d即可進(jìn)行傳代處理。

　　PEMFs作用促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，加速了體外骨形成［8］。 ALP是成骨細(xì)胞的早期標(biāo)志酶，可標(biāo)志成骨分化的開(kāi)始。 有研究發(fā)現(xiàn)，MSCs向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，ALP水平有時(shí)間依賴性，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量增加［9］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)5 d的刺激， rMSCs中可檢測(cè)到ALP的表達(dá)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)水平逐漸增高，說(shuō)明rMSCs向成骨細(xì)胞分化，并開(kāi)始分泌骨基質(zhì)。 PEMFs刺激18 d，四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記可觀察到相當(dāng)數(shù)量和面積的特征性金黃色，進(jìn)一步證實(shí)rMSCs向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)了成骨細(xì)胞的體外骨形成。 繼續(xù)刺激，可肉眼觀察到圓形或卵圓形的礦化小結(jié)，經(jīng)茜素紅染色為陽(yáng)性，對(duì)照組也出現(xiàn)弱陽(yáng)性反應(yīng)。 可能的原因是由于培養(yǎng)液或血清的誘導(dǎo)，也可能是由于體外獲取的原代細(xì)胞含有少量成骨細(xì)胞，rMSCs的分離方法還需要進(jìn)一步改進(jìn)。

　　PEMFs有促進(jìn)rMSCs增殖和成骨分化兩方面的作用，是PEMFs有效治療骨折、骨質(zhì)疏松等骨科疾病的可能機(jī)制之一。 但是將PEMFs用于促進(jìn)rMSCs增殖以獲得大量組織工程種子細(xì)胞的時(shí)候，需要找到更好的磁場(chǎng)參數(shù)和培養(yǎng)條件，控制rMSCs的分化，這些都有待今后進(jìn)一步深入探討。

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