ELISA的試劑的制備-檢驗士：
ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。
（一）固相載體
可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點是還能兼作反應(yīng)的容器，最后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，國際通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結(jié)果?，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10%.
與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其它免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和一個典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較測定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別最大，這種載體就是這一ELISA測定的最合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
（二）抗原和抗體
在ELISA實施過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實驗是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價高、親和力強(qiáng)。
ELISA所用抗原有三個來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原和多肽抗原均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對那些天然抗原不易得到的試驗，更顯出其獨到之處。
用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的?？寡宄煞謴?fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，則效果更好。
（三）免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（最常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。
（四）酶和底物
ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。ELISA中最常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。
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