[兒科學(xué)]Taq DNA聚合酶

答復(fù)：本題選E。

　　Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌（Thermusaquaticus）yT1株分離提取的。yT是 一種嗜熱真菌，能在70～75℃生長(zhǎng)。該菌是1969年從美國(guó)黃石國(guó)家森林公園火山溫泉中分離的。該酶基因全長(zhǎng)2496個(gè)堿基，編碼832個(gè)氨基酸，酶蛋白分子為 94KDa.其比活性為200000單位/mg.75～80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核苷 酸，70℃延伸率大于60個(gè)核苷酸/秒，55℃時(shí)為24個(gè)核苷酸/秒。溫度過(guò)高（90℃以上） 或過(guò)低（22℃）都可影響Taq DNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無(wú)DNA合成， 但確有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性。在92.5℃、95℃ 、97.5℃時(shí)，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min，40min和5～6min后，仍可 保持50%的活性，實(shí)驗(yàn)表明。PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為95℃～20℃，50個(gè)循環(huán)后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條 件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因。Taq DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄活性， 其作用于類似逆轉(zhuǎn)錄酶。此活性溫度一般為65～68℃，有Mn2 存在時(shí)，其逆轉(zhuǎn)錄活性 更高。

　　TaqDNA聚合酶是Mg2 依賴性酶，該酶的催化活性對(duì)Mg2 濃度非常敏感。以活性程度 很低的鮭魚(yú)精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8mmol/L時(shí)，用不同濃度Mg2 進(jìn)行 PCR反應(yīng)10min，測(cè)定結(jié)果為Mgc12濃度在2.0mmol/L時(shí)該酶催化活性最高，此濃度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2 過(guò)高就抑制酶活性，當(dāng)Mgcl2濃度在 10mmol/L時(shí)可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2 能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2 濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)化濃度。一般反應(yīng) 中Mg2 濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L.適當(dāng)濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)明顯抑制該酶的活性。