使基因擴增檢驗技術有效地應用于臨床，更好地為疾病的預防、診斷和治療服務，保證檢驗質量，特制定本規(guī)范。

　　一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設置及其管理

　　臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文）附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》。為避免污染，必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設置標準》設置臨床基因擴增檢驗實驗室。

　　臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設備。各區(qū)域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內移出從而造成不同的工作區(qū)域間設備物品發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物配制和擴增區(qū)（簡稱擴增區(qū)）至產物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

　　清潔方法不當也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

　?。ㄒ唬┰噭┵A存和準備區(qū)

　　下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

　　貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經過產物分析區(qū)。在打開含有反應混合液的離心管或試管前，應將其快速離心數秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用后，應將其分裝貯存?zhèn)溆?，避免由于經常打開反應管吸液而造成污染。

　　含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數來決定。

　　主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預試驗來檢查，評價結果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術（在第一個高溫變性步驟后加入酶），聚合酶也可不包含在主反應混合液中。

　　在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。

　　嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經高壓處理。

　　工作結束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調至實驗臺上60~90cm內照射。由于擴增產物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。

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　　下述操作在該區(qū)進行：臨床標本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

　　要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區(qū)內不必要的走動。可通過在本區(qū)內設立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。

　　用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等）如出現外濺，則必須分別處理并作出記錄。

　　對實驗臺適當的紫外照射（254nm波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。

　　樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。

　　用于RNA擴增檢測樣本制備好以后，應立即進行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要，應在標本制備區(qū)設置一個以上的溫育裝置。

　　cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉錄，其較cDNA合成后再開蓋以調節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。

　　待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增。

　　（三）擴增區(qū)

　　下述工作在本區(qū)內進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA（來自樣本制備區(qū)）的加入和主反應混合液（來自試劑貯存和制備區(qū)）制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。

　　不能從本區(qū)再進入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。

　　為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的走動。如有加樣則應在超凈臺內進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。

　　完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

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　　下述操作在本區(qū)內進行：擴增片段的測定。

　　核酸擴增后產物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法（同位素標記或非同位素標記）、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法等。目前國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。

　　本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實驗室內傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。

　　由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的安全防護。

　　本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓情況下（如安裝排風扇）可減少擴增產物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。

　　二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證

　　臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

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　　常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。

　　玻璃器皿在使用前應高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。

　　全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。

　　臨床用于RNA（如HCV RNA）擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快（3小時以內）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內分離血清。

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　　用于DNA擴增檢測的標本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標本應及時送至實驗室。

　　由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩(wěn)定化處理，如流行病學調查的現場采樣。異硫氰酸胍鹽（Guanidine thiocyanate，GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1：4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清（漿）中的RNA酶不可逆失活。經上述穩(wěn)定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。

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　　標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩(wěn)定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩(wěn)定化處理的標本。通常在運送時，應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。

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　　臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液（pH 7.5-8.0）中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。

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　　標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標本本身（如血紅素及其前體或降解產物）或核酸提取過程中殘留的有機溶劑（如酚、氯仿等），這些物質對其后的Taq酶擴增反應步驟具有強烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴增測定。當標本為痰時，則必須先進行液化處理，再提取核酸。需注意的是，液化時不能加熱，液化時間不能過長。此外，當靶核酸為RNA時，逆轉錄PCR測定失敗的常見原因是標本在運送前未經充分的穩(wěn)定化處理及核酸提取試劑的RNA酶的污染。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現有RNA降解的證據，實驗室則應拒絕接受標本，要求重新采取標本，并對運送者給以詳細的指導。對于后者，建議使用高質量的商品核酸提取試劑。

　　（六）靶核酸的逆轉錄（RT）和擴增

　　1、靶RNA的逆轉錄

　　cDNA合成為逆轉錄PCR中的第一個酶反應步驟，所產生的cDNA為靶RNA的反向互補鏈，為后面擴增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：（1）逆轉錄效率的降低或完全缺乏。其可能的原因有逆轉錄酶質量不高、試劑降解變質或加樣錯誤等；（2）用于逆轉錄的標本中存在逆轉錄或Taq酶的抑制物（如酚、氯仿、血紅素等）；（3）RNA酶的存在導致RNA的降解。

　　2、核酸的擴增

　　有多種因素可引起核酸擴增檢測的假陽性或假陰性結果，如擴增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不對、Mg²⁺濃度不佳、患者標本或試劑受污染等。擴增儀孔中熱傳導的均一性極為重要，必須定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導的一致性進行檢查，以避免假陰性結果。

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　　在實際工作中，常見有以下幾種污染類型：擴增片段的污染（產物污染）；天然基因組DNA的污染、試劑污染（貯存液或工作液）以及標本間交叉污染（如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本）。臨床基因擴增檢驗實驗室中污染的最主要來源是擴增產物的污染。

　　由于一旦發(fā)生污染后，再圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣，所以防止污染重在預防。但如果發(fā)生了污染，實驗就必須停止，直到發(fā)現了污染源為止，并且實驗結果必須作廢。

　　1、測定分析前的污染源

　　測定分析前實驗材料的污染主要來自非病人標本來源的核酸。

　　2、測定分析階段的污染源

　　通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及到的實驗設備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑（例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油）、商品酶制劑、消耗品（如反應管，吸頭）和實驗設備（如加樣器、離心機）等。

　　在前面三個工作區(qū)中，不當的實驗操作會引起所使用的試劑、消耗品或實驗設備的污染。而在產物分析區(qū)，當吸取擴增產物用于檢測時，非常容易引起污染，因此必須制定標準操作程序（SOP），并嚴格執(zhí)行。

　　3、污染的避免

　　要避免污染，首先應是預防而不是排除污染，前面所述對工作區(qū)的嚴格劃分的目的即是為了預防污染。

　　為避免以前測定中所產生的擴增產物的污染，可設法將其破壞掉。如在擴增反應中用dUTP取代部分dTTP，使得產生的特異擴增片段含有尿嘧啶，這樣擴增前在反應混合液中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），可破壞來自以前測定的擴增產物，從而避免其對以后要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補骨脂素光化學產生DNA加合物，由于DNA加合物對擴增沒有反應但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。

　　上述防污染方法只在一定程度上有效，所以不能用其來替代嚴格的實驗室設置和管理，尤其是這些方法不能防止外來非擴增的天然DNA的污染。

　　4、去除污染的措施

　　工作完后必須定期對實驗室采取有效的去污染措施，結合各種不同的方法可達到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：（1）用10%（v/v）次氯酸鈉清潔表面；（2）試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面；（3）實驗設備如加樣器的高壓消毒。

　?。ò耍U增產物的分析

　　擴增產物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。

　　雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。

　　最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉錄的反義RNA探針。探針的標記物常用的有生物素、地高辛、熒光素和同位素等。

　　在擴增后的雜交檢測中，應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性，還會給檢測信號的特異性帶來負面影響。相反，提高溫度和/或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此，嚴密控制溫度和試劑的離子強度是避免假陽性和假陰性結果的先決條件。要注意的是，溫度和離子強度不能同時改變。

　?。ň牛┵|量控制

　　質量控制包括兩個方面，即室內質量控制（以下簡稱質控）和室間質量評價。

　　1、室內質量控制

　　必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性，所以標本制備、逆轉錄、擴增本身和產物分析中的每一步都要求有質控措施。

　?。?）標本制備：

　　常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb，用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30-40kb.明顯出現降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內）在經瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠對酶活性的抑制劑進行質控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，質量好的DNA提取物，A260/A280比值應該在1.75~2.0之間否則，殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。

　　最快的對總RNA提取質量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳，這一點跟DNA分離相同。但如果對結果有疑問，就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體RNA（28S、18S和5S）在凝膠上出現的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解，則出現大量低分子量帶或出現帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結論。

　　對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價標本出現溶血、脂血和黃膽情況下標本處理方法對擴增檢測的影響，避免由于標本處理方法的不當而出現假陰性結果。此外，還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。

　　（2）逆轉錄和擴增：本部份包括陽性質控和陰性質控。

　　對逆轉錄和核酸擴增的質控既可使用內標質控方法也可采用外標質控方法。逆轉錄-擴增檢測的內標通常為在整個細胞周期中均勻表達的mRNA，如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外，也可在標本制備時將外來內標加入到樣本中共同提取、逆轉錄及擴增。當標本中存在逆轉錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉錄酶失活，內標即會表現為陰性結果。

　　對于DNA測定內標可使用對有機體存活所必須的靶基因，如維生素D血漿結合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測，內標多采用人工制備的競爭性內標。內標可以監(jiān)控每一擴增孔中假陰性的產生情況。

　　目前的商品試劑盒大部分沒采用內標方法質控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時，應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質控樣本，與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增，以判斷逆轉錄及擴增檢測的效果。

　　使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反應液的質量，還可獲得有關PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。

　　每一個PCR實驗中都必須設有外加陰性質控（污染監(jiān)測質控），為判斷擴增過程中污染出現的階段，陰性質控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反應液但不含擴增模板的反應管、陰性標本等。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質量。

　　在擴增靶RNA的RT-PCR實驗中，可做省略逆轉錄的污染質控，通過這種方法，可發(fā)現以前擴增的DNA片段所引起的污染。

　?。?）板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結果的錯誤解釋。

　?。?）測定結果的評價與報告：采用實時熒光定量PCR檢測方法，在判斷結果時，應先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結果分析的干擾。

　　結果的報告必須簡單清楚。定性測定報告"陽性"或"陰性"即可。定量測定則必須報告量的多少，如結果高于測定方法線性范圍上限，則對樣本稀釋后再測，結果乘上稀釋倍數；如結果低于方法的測定范圍下限，則報？lt多少即可，不能報告為"0"或"陰性".

　　2、室間質量評價

　　所有開展臨床基因擴增檢驗的實驗室都必須參加由衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的全國臨床基因擴增檢驗項目的室間質量評價，評價結果將作為其開展臨床基因擴增檢驗的依據之一。

　　本工作規(guī)范自公布之日起實施。