自20世紀(jì)70年代，F(xiàn)aulk等（1971）用膠體金作為特殊標(biāo)記物進(jìn)行研究以來(lái)，建立的各種免疫膠體金技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)捷等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、環(huán)境及食品檢測(cè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。免疫膠體金技術(shù)的反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)由金顆粒、抗原與抗體動(dòng)態(tài)結(jié)合的反應(yīng)過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中每個(gè)環(huán)節(jié)的好壞都直接影響試驗(yàn)的成敗。而試驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)環(huán)節(jié)又受到很多因素的影響和制約，下面將影響免疫膠體金技術(shù)的因素作一分析，為成功制備膠體金檢測(cè)產(chǎn)品提供參考。

1、耗材的選擇

1.1不同型號(hào)膜的篩選硝酸纖維素膜的型號(hào)在試驗(yàn)中至關(guān)重要，作為反應(yīng)載體影響到整個(gè)試驗(yàn)的成敗。不同的生產(chǎn)廠家生產(chǎn)硝酸纖維素膜時(shí)使用的聚合物和表面活性劑的來(lái)源、類型和數(shù)量均大不相同，對(duì)生產(chǎn)出的膜的性能產(chǎn)生較大影響—膜的孔徑和分布結(jié)構(gòu)不同。膜孔徑減小，膜的實(shí)際可用表面積遞增，膜結(jié)合蛋白的量也遞增；膜孔徑越小，層析速度也越慢，金標(biāo)復(fù)合物通過(guò)T線的時(shí)間就越長(zhǎng)，反應(yīng)也就越充分；因此膜孔徑越小靈敏度越高，但是同時(shí)也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì)，也就是假陽(yáng)性越高。用于金標(biāo)免疫快速試驗(yàn)的膜多為硝酸纖維素膜或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜，不同的包被蛋白對(duì)膜有特定要求，試驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)選擇適合孔徑大小和分布結(jié)構(gòu)的膜，找到合適的平衡點(diǎn)，使膠體金的標(biāo)記物在膜上的流動(dòng)速率為最佳。

1.2結(jié)合墊的選擇結(jié)合墊位于層析系統(tǒng)的中間，一般要求結(jié)合墊的網(wǎng)格均一且非特異性吸附低，能很好地負(fù)載膠體金標(biāo)記物和待檢測(cè)樣品，而不被吸附；玻璃纖維素膜具備以上優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有一定的硬度，為試驗(yàn)中常用。

1.3樣品墊及吸水紙的選擇樣品墊和吸水紙位于膠體金免疫層析系統(tǒng)的兩端，對(duì)于膠體金層析系統(tǒng)功能的實(shí)現(xiàn)起著舉足輕重的作用。試驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)試紙條檢測(cè)樣品的性質(zhì)選擇合適的樣品墊和吸水紙，保證樣品在樣品墊形成的通道中快速地流動(dòng)而不被非特異性地吸附或者改變樣品的性質(zhì)。如檢測(cè)樣品為血清，則可選擇網(wǎng)格較疏松的玻璃纖維素膜即可；如果檢測(cè)樣品為毒素，則可選擇質(zhì)量好的吸水紙和樣品墊。吸水紙則要有很好的蓄水能力，保證樣品中所用的液體都經(jīng)過(guò)膜的反應(yīng)區(qū)而被樣品墊吸收和蓄積。

2、關(guān)于膠體金的制備

制備顆粒均勻、分散度好的膠體金在金標(biāo)免疫快速試驗(yàn)中非常關(guān)鍵，如果金顆粒直徑的變異范圍太大就會(huì)影響到試驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，如果金顆粒的形狀不規(guī)則或粒徑不均一，使得膠體金標(biāo)記物容易解離和沉淀而產(chǎn)生金標(biāo)擴(kuò)散不完全、反應(yīng)區(qū)底色過(guò)深和假陽(yáng)性現(xiàn)象；而且膠體金質(zhì)量不好，膠體金結(jié)合物就不能快速而完整的從玻璃纖維上解離，從而影響試驗(yàn)結(jié)果。

膠體金的制備除了保證藥品的質(zhì)量外，制備過(guò)程中的細(xì)節(jié)關(guān)乎膠體金制備的成敗。首先是操作環(huán)境和所用容器的清潔度。所有進(jìn)入溶膠內(nèi)的污物都會(huì)干擾膠體金顆粒的生成或使生成的膠體金出現(xiàn)聚堆現(xiàn)象，容器最好經(jīng)酸洗和硅化處理。操作環(huán)境應(yīng)保持清潔無(wú)塵粒，最好有專用工作區(qū)。其次，配制溶液均需使用雙蒸水或三蒸去離子水配制，燒制膠體金最好用去離子水。再者是不同的還原劑對(duì)膠體金質(zhì)量的影響。膠體金制備基于還原法，改變還原劑的性質(zhì)和濃度，可制備粒徑不同的膠體金懸液。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇膠體金的粒徑，根據(jù)選擇的粒徑確定還原劑，如制備金顆粒直徑在5～12nm的膠體金溶液用白磷或抗壞血酸還原氯金酸；如制備大于12nm直徑的金顆粒的膠體金則用檸檬酸三鈉還原氯金酸。此外不同的燒制方法、膠體金的制備量、還原劑的加入方式、加熱容器的大小及加熱的時(shí)間等也影響膠體金顆粒的大小和均一性。根據(jù)所需膠體金的粒徑和數(shù)量，結(jié)合自身試驗(yàn)條件選擇合適的膠體金制備方法。

3、標(biāo)記蛋白與相關(guān)抗原、抗體的制備

標(biāo)記蛋白、T線和C線的抗原或者抗體的純度和濃度直接影響金標(biāo)探針的質(zhì)量。獲得純度高、濃度適中的抗原、抗體，關(guān)鍵在于制備和純化方法的選擇及條件的優(yōu)化。試驗(yàn)前須采用高速離心去雜質(zhì)，應(yīng)用飽和硫酸銨沉淀、親和層析、透析除鹽等一系列處理方法，盡可能去除單克隆抗體、二抗和相關(guān)蛋白溶液中的高濃度的雜質(zhì)和多余離子，避免其干擾目的蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚；特別是硼酸鹽和磷酸鹽不利于膠體金和蛋白的結(jié)合，應(yīng)盡量避免接觸。同時(shí)，充分處理各種大分子蛋白，使其盡量分散為單體和具有適當(dāng)?shù)姆肿淤|(zhì)量，提高膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合比，便于與膠體金充分而穩(wěn)定的結(jié)合。

4、膠體金的標(biāo)記

膠體金標(biāo)記的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是標(biāo)記時(shí)的pH和最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量的確定。根據(jù)膠體金標(biāo)記的原理，只有在pH接近和稍高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，膠體金蛋白質(zhì)的吸附力最強(qiáng)；pH過(guò)高過(guò)低都不利于兩者的結(jié)合，因此標(biāo)記時(shí)選擇精密的酸堿度測(cè)定儀器或者試紙條，采用不同方法重復(fù)校正，并進(jìn)行梯度試驗(yàn)找到最佳的標(biāo)記pH.溶膠與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例是否合適是影響標(biāo)記成功的一個(gè)重要因素。過(guò)多蛋白質(zhì)標(biāo)記，造成浪費(fèi)的同時(shí)引起試紙的拖帶現(xiàn)象；過(guò)少蛋白質(zhì)標(biāo)記，導(dǎo)致膠體金標(biāo)記不完全，從而降低試紙的靈敏度及假陽(yáng)性現(xiàn)象的出現(xiàn)。也需要在試驗(yàn)中進(jìn)行梯度試驗(yàn)，反復(fù)比較不同標(biāo)記量的標(biāo)記物在破壞試驗(yàn)中的穩(wěn)定性，確定最佳的標(biāo)記量。

5、膜包被條件的優(yōu)化處理

膜的包被條件，包括膜的封閉、環(huán)境的濕度、T線和C線上抗原或抗體的濃度、點(diǎn)膜條件、溫度、包被時(shí)間等，需要結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行反復(fù)調(diào)整。包被過(guò)程中需要特別注意以下兩點(diǎn)：①膜上T線和C線抗原或抗體的包被量要相對(duì)飽和；②包被后的膜一定要在適宜的溫度下徹底干燥，否則會(huì)造成拖帶、顯色不清晰，靈敏度也大受影響。

5.1封閉對(duì)使用的膜進(jìn)行處理，特別是進(jìn)行封閉是一個(gè)十分有爭(zhēng)議的問(wèn)題，理論上來(lái)說(shuō)購(gòu)買(mǎi)回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的，直接點(diǎn)膜就可使用。如果點(diǎn)膜前將膜浸泡在封閉液內(nèi)進(jìn)行封閉處理，必然擾亂了膜內(nèi)正常的物質(zhì)分布，由此引發(fā)了許多不必要的麻煩。但是如果在實(shí)際的試驗(yàn)操作過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有進(jìn)行封閉的膜出現(xiàn)非特異性條帶或者出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，或遇到膜不封閉就無(wú)法將蛋白質(zhì)或抗體包被在膜上的問(wèn)題，就應(yīng)考慮封閉問(wèn)題。建議在制作試紙條過(guò)程中根據(jù)各自標(biāo)記物的性質(zhì)及其在膜上的顯色情況來(lái)選擇封閉與否，如果標(biāo)記效果比較好且在膜上顯色清晰而無(wú)拖帶及假陽(yáng)性現(xiàn)象出現(xiàn)，則完全沒(méi)有必要進(jìn)行膜的封閉。反之，可進(jìn)行膜的封閉，查找不理想現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。用來(lái)對(duì)膜進(jìn)行封閉的物質(zhì)很多，多選用大分子蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（PEGMW20000）等。常用的封閉方法有流動(dòng)封閉和膜上定點(diǎn)封閉，前者將封閉物處理在樣品墊上，后者將作用物質(zhì)配成溶液噴涂在膜的特定位置上。

5.2環(huán)境濕度環(huán)境濕度對(duì)點(diǎn)膜過(guò)程非常重要。最佳濕度一般在45%～65%.濕度過(guò)低，膜上容易聚集靜電荷，點(diǎn)膜容易出現(xiàn)散點(diǎn)，導(dǎo)致測(cè)試時(shí)出現(xiàn)疏水斑；濕度過(guò)高，膜上毛細(xì)作用加強(qiáng)，點(diǎn)膜容易引起T線、C線變寬甚至擴(kuò)散。為了保證點(diǎn)樣時(shí)膜濕度的均一性，一般在點(diǎn)樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時(shí)間。

5.3T線和C線上抗原或抗體的濃度T線和C線上抗原或抗體的包被濃度直接影響其與金標(biāo)記物的結(jié)合比例，最終影響試紙條條帶的顯色效果。包被濃度過(guò)低，膜上的條帶顯色不清晰或出現(xiàn)條帶中空現(xiàn)象；包被濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致C線不顯色或者出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象。若要獲得反應(yīng)穩(wěn)定、顯色清晰的試紙條，須對(duì)2條線上抗原或抗體的配合濃度及兩者與金標(biāo)記物的結(jié)合比進(jìn)行調(diào)整和比對(duì)，以期得到最佳的組合。

5.4點(diǎn)樣位置不同的T線、C線點(diǎn)樣位置將帶來(lái)不同的靈敏度，點(diǎn)樣位置上移，金標(biāo)復(fù)合物通過(guò)T線位置時(shí)速度變慢，反應(yīng)時(shí)間增加，靈敏度升高；反之靈敏度降低?？刹捎眠@個(gè)方法來(lái)改變靈敏度和消除假陽(yáng)性。

5.5點(diǎn)樣儀器目前有2種點(diǎn)樣方式，劃膜式和非接觸點(diǎn)膜式。非接觸點(diǎn)膜式優(yōu)于劃膜式，劃膜式需用軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質(zhì)較為軟脆，劃管會(huì)在其表面留下印痕。劃痕容易對(duì)層析的金標(biāo)復(fù)合物形成阻力，導(dǎo)致假陽(yáng)性，同時(shí)容易出現(xiàn)跑板時(shí)在T線位置出現(xiàn)若有若無(wú)一條細(xì)線，影響結(jié)果的判定。點(diǎn)樣儀器不僅可以控制T線、C線點(diǎn)樣位置，也可通過(guò)點(diǎn)膜儀器各種參數(shù)的調(diào)整控制T線與C線寬度及噴膜速度等細(xì)節(jié)，達(dá)到最好顯色效果。需要在試驗(yàn)過(guò)程反復(fù)調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)做比對(duì)試驗(yàn)，觀察試紙條的顯色情況來(lái)決定。

6、緩沖液

緩沖液構(gòu)成膠體金免疫層析技術(shù)的液相載體，在不影響膠體金與蛋白質(zhì)、抗原與抗體、硝酸纖維素膜與T線及C線蛋白結(jié)合的前提下，并為它們的結(jié)合反應(yīng)提供最佳的酸堿環(huán)境。緩沖液并不是通用的，不同的反應(yīng)體系需要不同的緩沖液來(lái)支持，這就需要試驗(yàn)者結(jié)合自己的試驗(yàn)嘗試不同的緩沖液，確定適合自己的緩沖液配方。常用的緩沖體系是在選用的緩沖液（磷酸鹽、硼酸鹽等）中添加相應(yīng)的作用物質(zhì)配制而成，所謂作用物質(zhì)是解決反應(yīng)體系出現(xiàn)的某一特定問(wèn)題而添加的相應(yīng)物質(zhì)。比如通過(guò)在緩沖液中添加適量的表面活性劑，可起到增加親水力、增色和避免線條中空現(xiàn)象；也可同時(shí)添加幾種物質(zhì)，通過(guò)它們之間的相互協(xié)同作用共同解決相關(guān)的問(wèn)題，如少量NaCl，減少信號(hào)強(qiáng)度，消除假陽(yáng)性；糖和聚乙二醇作為保護(hù)劑，能減緩老化速度，也可以增加親水力，但也要注意作用物質(zhì)的添加宜簡(jiǎn)不宜繁。試紙條制備過(guò)程中的很多處理液都是在選擇的緩沖液的基礎(chǔ)上添加相應(yīng)的作用物質(zhì)配置而成的（如封閉液、結(jié)合墊處理液等）。

7、樣品的處理與結(jié)果的判定

7.1樣品的處理方法和加樣量臨床送檢標(biāo)本（如全血、血清、血漿），不同的單位和檢測(cè)人員采用的處理方法不統(tǒng)一，也會(huì)對(duì)結(jié)果判定造成影響。如血漿內(nèi)大量的纖維蛋白原，影響到層析的速度及均一性，直接影響到抗原抗體結(jié)合，處理不當(dāng)甚至出現(xiàn)一種非特異性結(jié)合。檢測(cè)時(shí)樣品的添加量要相對(duì)充足，使膜上的反應(yīng)充分進(jìn)行，以便得到清晰的結(jié)果。加樣量過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致樣品在試紙條上層析不充分而出現(xiàn)假陰性。

7.2結(jié)果的判定由于使用膠體金產(chǎn)品的工作人員分布在不同的層次、不同的部門(mén)，判定結(jié)果時(shí)有很大的隨意性，判定時(shí)間不統(tǒng)一，特別是在工作環(huán)境、溫度、濕度的影響下，根據(jù)標(biāo)志線的顯色時(shí)間隨意判定結(jié)果，而忽略了廠家制定的有效時(shí)間。因此在檢測(cè)時(shí)要求工作人員能及時(shí)分辨出試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的假陽(yáng)性、假陰性現(xiàn)象及異常條帶，能在查找原因后復(fù)檢或結(jié)合相關(guān)的檢測(cè)方法重新檢測(cè)進(jìn)行比對(duì)和確認(rèn)，避免漏檢和錯(cuò)檢。

8、產(chǎn)品的保存和驗(yàn)證

8.1產(chǎn)品的儲(chǔ)存剛生產(chǎn)出的試紙條或檢測(cè)卡一般含有5%～10%的水分，儲(chǔ)存過(guò)程中環(huán)境過(guò)干過(guò)濕都不利于產(chǎn)品的儲(chǔ)存。環(huán)境過(guò)干膜上的水分蒸發(fā)，會(huì)使膜變得疏水、帶電荷并變脆；環(huán)境過(guò)濕影響金標(biāo)記物的質(zhì)量及T線、C線的顯色效果；因此成品的試紙條和檢測(cè)卡應(yīng)進(jìn)行防潮設(shè)計(jì)，存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)一般要求避光、密封保存。環(huán)境的溫度也影響標(biāo)記物、抗原、抗體的生物活性，在低溫條件下可有效延長(zhǎng)產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間。

8.2成品驗(yàn)證試驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)包括特異性試驗(yàn)、線性靈敏度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、樣品檢測(cè)、干擾試驗(yàn)、批間批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)等10個(gè)試驗(yàn)，綜合評(píng)定產(chǎn)品的質(zhì)量。成品驗(yàn)證試驗(yàn)需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，特別是產(chǎn)品的穩(wěn)定性試驗(yàn)需要在很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)定期抽樣檢測(cè)。應(yīng)結(jié)合自己的試驗(yàn)，參照相應(yīng)的國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，制定針對(duì)性的試驗(yàn)檢測(cè)成品的特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性及靈敏度等指標(biāo)，為進(jìn)一步的優(yōu)化和最終制成優(yōu)質(zhì)的檢測(cè)試紙條或檢測(cè)卡提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，膠體金免疫層析技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)受到種種因素的影響，也使得以免疫膠體金技術(shù)建立的檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中也存在著一些問(wèn)題，如膠體溶液的穩(wěn)定性較差、存放時(shí)間相對(duì)較短及靈敏度受到多種因素的影響而下降等，導(dǎo)致免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制。隨著科技的進(jìn)步，這些問(wèn)題將在今后的研究中被逐步改善，免疫膠體金技術(shù)也將更進(jìn)一步顯示其巨大的優(yōu)越性，實(shí)現(xiàn)半定量或定量檢測(cè)及多元化檢測(cè)，拓寬其在光鏡、電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡技術(shù)、生物芯片等領(lǐng)域內(nèi)中的應(yīng)用。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)|搜索整理